Післягеномна ера. Протеоміка: нові горизонти в фармакології

Значення більшості генів у життєдіяльності клітини ще не з’ясовано. Провідні вчені світу сподіваються визначити точну функціональну роль генів шляхом розшифрування протеому — повного набору білків, що кодуються геномом. Виникла нова наука протеоміка, яка вивчає структуру та функцію протеому. Майже одночасно з оприлюдненням попередніх результатів дослідження структури генетичного коду людини було засновано Організацію з вивчення людського протеому (Human Proteomе Organization (HUPO)), завдання якої — координування широкомасштабних досліджень у галузі вивчення білків і забезпечення їх наукової та фінансової підтримки. Фахівці вважають, що порушення біосинтезу та процесингу білків лежать в основі молекулярних механізмів розвитку захворювань. Як відзначив один із засновників HUPO, білки відіграють ключову роль в життєдіяльності клітини та розвитку захворювання, тому без конкретних зусиль фахівців у галузі протеоміки цінні досягнення геноміки реалізувати буде неможливо (Abbott A. And now for the proteome. . . // Nature. — 2001. — 409. — P. 747). Нові розробки у галузі протеоміки, поза всяким сумнівом, дадуть поштовх бурхливому розвитку біотехнологічних методів у сучасній фармакології та фармацевтичній індустрії і відкриють широкі можливості ефективного лікування більшості захворювань.

ВІД ГЕНОМІКИ ДО ПРОТЕОМІКИ

Якщо за нормальних умов геном є стабільним, то протеом — надзвичайно динамічний і змінюється залежно від функціонального стану клітини. Предметом вивчення протеоміки є не лише якісний та кількісний склад білків, але й визначення їх функції, локалізації, модифікацій, взаємодії з іншими молекулами тощо. На сьогоднішній день вже охарактеризовано цілу низку білків. Однак робота з розшифрування протеому ведеться значно повільніше, ніж геному. За підрахунками, оптимальним був би скринінг декількох тисяч білків за день, однак сьогоднішній темп аналізу білків складає десятки–сотні за день. Така низька швидкість структурного аналізу білків зумовлена використанням надзвичайно тонкої та трудомісткої технології. На першій стадії аналізу використовують двовимірний гель-електрофорез, який з 70-х років минулого століття все ще є «золотим стандартом» протеомної технології. В результаті проведення цього етапу дослідження звичайно виявляють до 1500 білкових плям. На другій стадії кожну пляму виділяють і обробляють відповідними ферментами. На третій стадії утворені пептидні фрагменти аналізують за допомогою мас-спектрометрії. Набір характерних пептидних фрагментів індивідуального білка — це «відбиток пальця», котрий можна легко порівняти з уже відомими фрагментами каталогізованих білків. Нещодавно почали застосовувати нові технології з використанням іммобілізованих на скляній пластинці антитіл, які зв’язують специфічні білки (Hadlington S. Snipping away at the human genome // Scrip Magazine. — 2000. — 94. — P. 55–57).

Крім того, білки є набагато складнішими, ніж нуклеїнові кислоти. Їх активність істотно змінюється внаслідок приєднання до молекули білка залишків фосфорної кислоти, певних цукрів, жирних кислот тощо. Тобто один і той самий білок може мати різну просторову будову, розташування в клітині, функцію та активність, що надзвичайно ускладнює розшифрування його біологічного значення. Більше того, один і той самий ген може кодувати різні білки. Це залежить від того, де починається і де закінчується зчитування генетичної інформації з матричної РНК при її трансляції. Ситуація ускладнюється ще й тим, що один білок може виконувати декілька функцій і навпаки, одна й та сама функція може забезпечуватися декількома білками (Fields S. Рroteomics: рroteomics in genomeland // Science. — 2001. — 291. — Р. 1221–1224). Біохіміки вважають, що у звичайній спеціалізованій клітині одночасно присутні не більше 10 тис. білків у різних кількостях. Набір білків постійно змінюється залежно від фази клітинного циклу, ступеня диференціювання клітини, впливу факторів навколишнього середовища тощо.

ГЕНОМ/ПРОТЕОМ І ПАТОЛОГІЯ

На сьогоднішній день вже ідентифіковано сотні генів, зв’язок яких з певними захворюваннями чітко доведений. Значним успіхом є те, що практично щотижня надходить інформація про розшифрування нового «патологічного гена». З часом науковці сподіваються виявити ще більшу кількість таких генів. Наступним кроком після встановлення структури патологічного гена є аналіз функціональних властивостей білка даного гена. Після цього розробляється активна субстанція, яка має або замістити функцію ушкодженого білка, або, навпаки, інгібувати його активність. Іншим підходом є введення в клітину нормального варіанта ушкодженого гена.

Багато захворювань спричинено патогенною дією мікроорганізмів. Найновіші досягнення у галузі біотехнології уможливлюють вивчення взаємодії геному та протеому людини з геномом та протеомом патогенних мікроорганізмів. Це, наприклад, дає змогу розробити практичні заходи для боротьби з антибіотикорезистентністю багатьох штамів мікроорганізмів. Деякі захворювання обумовлені розладами регуляції метаболічних процесів та порушенням передачі гормональних сигналів усередину клітини. Їх ефективне лікування, як вважають учені, буде тісно пов’язано з використанням досягнень фармакогеноміки та фармакопротеоміки.

ГЕНОМІКА/ПРОТЕОМІКА І ФАРМІНДУСТРІЯ

Із розшифруванням геному людини у біотехнологічній індустрії відкрилося «друге дихання». Важливу роль у цьому відіграв Міжнародний консорціум з секвенування (встановлення послідовностей ДНК) геному людини (International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC), який координує зусилля 20 наукових лабораторій та академічних центрів світу (International Human Genome Sequencing Consortium // Nature. — 2001. — 409. — Р. 860–921). Альтернативний проект з розшифрування геному людини виконала приватна компанія «Селера геномікс» (Celera Genomics, Venter J.C. et al. // Science. — 2001. — 291. — Р. 1304–1351). Одержані результати загальнодоступні на веб-сайті www.sciencemag.org. З результатами досліджень, представленими IHGSC, можна ознайомитися в Інтернеті (http://genome.cse.ucsc.edu), де містяться відомості про структуру і розташування в хромосомах перших 2300 генів. Компанія «Селера геномікс» має намір розповсюджувати інформацію про структуру геному людини на комерційній основі.

Вже сьогодні деякі компанії успішно проводять клінічні випробування принципово нових лікарських засобів, розроблених з використанням досягнень геноміки та протеоміки, які призначені для лікування генетичних порушень, вірусних і онкологічних захворювань. Наприклад, доведено високу ефективність препарату Коагулін-В компанії «Avigen», який використовують для лікування гемофілії, tgDCC-E1A компанії «Targeted Genetics», призначений для генної терапії рецидивуючого раку голови та шиї, резистентного до стандартної терапії, тощо. Багато інших препаратів виявилися надзвичайно ефективними на стадії доклінічного випробування.

Нещодавно на засіданні Національної академії наук США компанія «Genset» оприлюднила результати доклінічних випробувань препарату Фамоксин — специфічного білка для лікування ожиріння. Доведено, що Фамоксин істотно знижує як рівень вільних жирних кислот у плазмі крові мишей, у раціоні яких був високий вміст жирів та цукрів, так і масу тіла. При цьому кількість спожитого корму залишалась незмінною. Компанія сподівається, що препарат можна буде застосовувати також для лікування цукрового діабету, деяких метаболічних розладів і захворювань ЦНС.

Англійські компанії «Proteom» та «Sense Proteomic» уклали угоду про співробітництво в галузі ідентифікації пептидів, що беруть участь у взаємодії внутрішньоклітинних білкових субодиниць різних іонних каналів. Пептиди, які проявлятимуть тропність до субодиниць іонних каналів, будуть використовувати як активні субстанції нових препаратів. Сьогодні іонні канали розглядають як важливу терапевтичну мішень при лікуванні захворювань ЦНС, серця, жовчного міхура. Впливаючи на білок-білкові взаємодії, фахівці сподіваються модифікувати активність іонних каналів різних типів.

Компанія «Новартіс» придбала комп’ютерну програму, розроблену швейцарською біоінформаційною компанією «GeneData», яка містить банк даних про геном та протеом і інтегрувала її з власною глобальною комп’ютерною системою з геноміки. Зараз ця компанія формує геномний портфель завдяки як власним зусиллям, так і партнерським стосункам з іншими компаніями та науковими інститутами.

«GeneData» має свої представництва в Швейцарії, Німеччині та США. В Японії її інтереси представляє компанія «Teijin Systems». Нещодавно «GeneData», «MWG Biotech», Вюрцбурзький університет (Німеччина) і Массачусетський технологічний інститут (США) об’єднали свої зусилля для проведення порівняльних досліджень генома Helicobacter pylori та Helicobacter hepaticus з метою виявлення генів Helicobacter hepaticus, «відповідальних» за канцерогенез. Ця бактерія здатна спричинювати хронічний активний гепатит, рак печінки та запальні захворювання кишечнику у мишей.

Як стало відомо, декілька компаній оголосили про намір залучити додаткові кошти у створення інноваційних препаратів на основі технологій геноміки та протеоміки. Так, компанія «Tularik» планує вкласти у розробку нових лікарських препаратів, призначених для лікування раку, цитомегаловірусної інфекції, ожиріння та цукрового діабету, 69 млн доларів США, а німецькі компанії «Evotec BioSystems» та «MorphoSys» — 64 і 25,8 млн євро відповідно. На розробку протипухлинних інгібіторів ангіогенезу американська компанія «EntreMed» виділила понад 25 млн доларів. З метою створення нових фармакологічних субстанцій для лікування тріщин заднього проходу та чоловічого гіпогонадизму «Cellegy Pharmaceuticals» має намір асигнувати 10,1 млн доларів, а «Transkaryotic Therapeutics» і бельгійська «Devgen» вирішили вкласти 132 млн доларів і 23 млн євро у створення та проведення доклінічних і клінічних випробувань нових біотехнологічних препаратів. На розробку вакцин нового типу французька компанія «Hybrigenics», яка спеціалізується на функціональній протеоміці, планує залучити 60 млн французьких франків (9,8 млн доларів), а німецька «Evax Technologies» — 16 млн німецьких марок (8,5 млн доларів). Австралійський уряд вжив низку заходів для заохочення місцевих фармацевтичних компаній до розвитку геномного та протеомного підходів у створенні нових препаратів. Так, уряд асигнував 614 млн австралійських доларів (410 млн доларів США) на проведення відповідних досліджень та створення державної агенції «Biotechnology Australia», яка координуватиме діяльність у галузі біотехнології. Японський уряд також вживає заходів для прискорення розвитку біотехнологічного сектора охорони здоров’я. До 2010 р. асигнування на цю галузь планується збільшити в 25 разів. Уряд пропонує приватним компаніям державну підтримку, а також заохочує до більш тісного співробітництва державні, академічні та галузеві інститути. У результаті проведення таких заходів наприкінці 2010 р. в Японії, за прогнозами експертів, налічуватиметься близько 1000 (!) нових біотехнологічних компаній.

ШЛЯХ ВІД ТЕОРІЇ ДО ПРАКТИКИ

На прикладі Ендостатину виробництва компанії «EntreMed» можна простежити шлях, який проходять практично всі препарати з моменту теоретичного обгрунтування їх застосування до виробництва у промислових масштабах. Так, встановлено, що малі пухлини не можуть розвиватися одночасно з первинними пухлинами, які досягли значних розмірів. Цей факт дав змогу висловити гіпотезу, згідно з якою первинна пухлина секретує певні інгібітори росту менших пухлин. На сьогоднішній день відомо 14 білків, які секретуються первинною пухлиною. Деякі з них пригнічують ріст малих новоутворень завдяки інгібуванню ангіогенезу, а інші, навпаки, стимулюють його. У 1996 р. фахівці компанії «EntreMed» використали білки, які пригнічували утворення судин в ракових пухлинах, а саме фрагмент колагену XVIII типу та фрагмент плазміногену як активні субстанції у процесі створення препаратів Ендостатин та Ангіостатин відповідно. Спільно із співробітниками американського Національного інституту раку вони ідентифікували і виділили ген активної субстанції Ендостатину, що дозволило вже у 1997 р. розробити рекомбінантну технологію отримання активної субстанції, ідентичної людському білку. Результати токсикологічних досліджень цього препарату засвідчили, що він не виявляє жодного токсичного ефекту. У квітні 1999 р. на щорічному засіданні Американської асоціації протиракових досліджень було доведено здатність Ендостатину на 90% пригнічувати метастазування меланоми у мишей на ранніх стадіях і на 70–90% — на пізніх. У липні того ж року FDA дало дозвіл на проведення І фази клінічних випробувань Ендостатину у лікуванні солідних пухлин. Перші пацієнти отримали цей препарат у вересні 1999 р. (Інститут Дана-Фарбер, США). Початкову стадію І фази клінічних випробувань фінансувала компанія «EntreMed», додаткові дослідження — Національний інститут раку. Для забезпечення пацієнтів достатньою кількістю Ендостатину компанія «EntreMed» у квітні 2000 р. уклала угоду про його виробництво з фірмою «Chiron Corporation». Науковці сподіваються, що у недалекому майбутньому препарат буде схвалено FDA, після чого він надійде на фармацевтичний ринок США.

ПІДСТАВИ ДЛЯ СТРИМАНОСТІ

До 1998 р. у США вже тисячі хворих отримали генетичну терапію. Ще рано робити остаточні висновки про віддалені результати лікування, однак більшість фахівців погоджуються з тим, що єдиним способом лікування багатьох невиліковних хвороб є генотерапія (Киселев Л.Л. Геном человека и биология ХХІ века // Вестник Российской Академии наук. — 2000. — 70, № 5. — С. 412–424). Вчені сподіваються, що геномні препарати відрізнятимуться надзвичайно високою селективністю та низькою токсичністю, оскільки будуть містити високоочищені індивідуальні гени та білки із заздалегідь відомими властивостями.

Слід зазначити й ті проблеми, з якими зіткнулися дослідники. Так, для того, щоб бажаний ген потрапив усередину клітини, його звичайно «пришивають» до аденовіруса. Останній легко проникає у клітину, транспортуючи потрібний ген. У літературі описано випадок, коли призначення «посадженого» на аденовірус ендотеліального фактора росту судин (стимулює утворення нових судин у пацієнтів з ішемічною хворобою серця) молодому чоловіку із захворюванням печінки призвело до летального кінця. Це сталося під час І фази клінічних випробувань, які проводилися в Пенсильванському університеті. Смерть молодого чоловіка викликала занепокоєння щодо безпеки подібних клінічних випробувань, а фармацевтична компанія, яка проводить клінічні випробування, навіть запропонувала тимчасово їх припинити.

Американський консультативний комітет з рекомбінантної ДНК розглядає можливість встановлення більш жорсткого контролю за проведенням клінічних випробувань препаратів, призначених для генної терапії. Зокрема, висунуто вимогу сповіщати Комітет протягом 15 днів про смертельні випадки, що трапляються під час проведення генної терапії. Не виключено, що в недалекому майбутньому Консультативний комітет буде розглядати питання, пов’язані з безпекою використання лікарських засобів, призначених для проведення генної терапії, перед тим, як вони потраплятимуть на розгляд FDA. Незважаючи на труднощі, перспективи успішного розвитку генної терапії та фармакопротеоміки очевидні (Hadlington S. Snipping away at the human genome // Scrip Magazine. — 2000. — 94. — P. 55–57).

ЧИ МАЮТЬ ПРОТЕОМНІ ПРОДУКТИ ПЕРЕВАГУ?

Перевагою протеомних продуктів є те, що їх можна транспортувати у клітини за допомогою ліпосом. Це дає можливість уникнути негативного впливу віруса-транспортера (вектора). Багатообіцяючим є використання трансгенних тварин, у клітини яких вводять певний ген, для продукції відповідних білків. Так, у грудні минулого року співробітники Рослінського інституту (де клонували вівцю Доллі) розробили технологію отримання людського білка, який виявляє виражені протипухлинні властивості. Науковці також вивели курку на ім’я Брітні з геном даного білка, тому в яйцях, знесених цією куркою, у високій кількості міститься зазначений білок. Учені цього інституту співробітничають з біотехнологічною фармацевтичною компанією «Viragen» у галузі розроблення нового протипухлинного препарату. Вони впевнені, що розроблена технологія дозволить випускати значно дешевші протеомні препарати у порівнянні з тими, які отримані за традиційними технологіями (A concerted attack on cancer // Scrip Magasine. — 2001. — 98. — P. 68–70).

ПРОГНОЗИ НА МАЙБУТНЄ

На Всесвітній конференції «Геном людини», яка відбулася минулого року у Ванкувері (Канада), обговорювалися питання розвитку геноміки людини на найближчі 40 років. Ф. Коллінз, керівник програми «Геном людини», висловив припущення, що до 2010 р. будуть розроблені методи генної терапії близько 25 спадкових захворювань та профілактичні заходи щодо зниження ризику виникнення найпоширеніших хвороб. За прогнозами експертів, до 2020 р. завдяки досягненням геноміки та протеоміки вдасться розробити й освоїти виробництво нових протидіабетичних і антигіпертензивних препаратів, а також інших принципово нових лікарських засобів, що дозволить проводити прицільну терапію онкологічних захворювань, спрямовану на модифікацію властивостей неопластичних клітин. Фармакогеноміка і фармакопротеоміка поступово стануть загальноприйнятим підходом у створенні багатьох лікарських препаратів. Передбачається, що до 2030 р. буде каталогізовано гени, які беруть участь у процесах старіння, а також проведено експериментальні дослідження зі збільшення тривалості життя людини.

До 2040 р. всі заходи з охорони здоров’я в США будуть базуватися на досягненнях геноміки та протеоміки. Хвороби виявлятимуть шляхом молекулярного моніторингу на ранніх стадіях, а для лікування більшості захворювань застосовуватимуть генну/протеомну терапію. Традиційні лікарські препарати будуть заміщені генними та білковими субстанціями, які продукує організм у відповідь на введення ліків. На думку фахівців, проведені заходи дозволять збільшити середню тривалість життя в США до 90 років.

Віктор Маргітич