Механизм «биологических часов», гравитационные волны и криогенная микроскопия: Нобелевские лауреаты делают революционные открытия

Механизм «биологических часов», гравитационные волны и криогенная микроскопия: Нобелевские лауреаты делают революционные открытияНобелевская премия — одна из наиболее престижных международных премий, ежегодно присуждаемая за выдающие­ся научные исследования, революционные изобретения, крупный вклад в культуру или развитие общества. Награды вручаются в таких направлениях, как физиология и медицина, физика, химия, литература, а также за содействие установлению мира во всем мире и по экономическим наукам памяти Альфреда Нобеля (присуждается с 1969 г. по инициативе Банка Швеции). В этом году Нобелевская премия по физиологии и медицине, присуждение которой состоялось 2 октября, открыла так называемую нобелевскую неделю: 3 октября общественности стали известны имена обладателей Нобелевской премии по физике, 4 октября — по химии, 5 октября — по литературе, 6 октября — Нобелевской премии мира, 9 октября — по экономическим наукам. Какие же революционные открытия сделали ученые?

ФИЗИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА

Нобелевская ассамблея при Каролинском институте (The Nobel Assembly at Karolinska Institutet), Швеция, присудила Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2017 г. трем американским ученым — Джеффри К. Холу (Jeffrey C. Hall), Майклу Росбашу (Michael Rosbash) и Майклу У. Янгу (Michael W. Young) — за открытие молекулярных механизмов, контролирующих циркадные ритмы. Информация о том, что физиология и поведение живых организмов подчиняются циркадным ритмам, то есть активность биологических процессов в организме связана со сменой времени суток (день/ночь), широко известна. Однако несмотря на то что наблюдения за этими процессами были задокументированы давно, существование «биологических часов» было официально подтверждено лишь в ХХ в. Со временем благодаря многочисленным экспериментам Нобелевским лауреатам удалось сложить воедино цепочку полученных данных и заглянуть внутрь «биологических часов», чтобы разгадать, как они работают.

В 1971 г. Сеймур Бензер (Seymour Benzer) и Рональд Конопка (Ronald Konopka) идентифицировали мутировавших представителей плодовой мушки (Drosophila) с измененным суточным ритмом их активности. В ходе экспериментов ученые пришли к выводу, что мутации были связаны с одним и тем же геном, позже названным period. Десять лет спустя ученые Дж. Хол и М. Росбаш из Брандейского университета (Brandeis University), США, совместно с М. Янгом из Рокфеллеровского университета (Rockefeller University), США, изолировали и охарактеризовали молекулярную структуру данного гена. Однако это не сразу натолкнуло исследователей на весь молекулярный механизм «биологических часов».

ЧТО ЗАСТАВЛЯЕТ ЧАСЫ «ТИКАТЬ»?

Ключевой особенностью жизни на Земле является способность живых организмов адаптироваться к окружающей среде. В разных географических точках окружающая среда разная, и организмы вынуждены адаптироваться к условиям, которые преобладают в их местоположении, с целью повышения выживаемости. Однако в какой бы точке мира не находились живые организмы, они реагируют на изменения освещения и температуры окружающей среды, которые происходят ежедневно в результате вращения Земли вокруг своей оси.

Чтобы адаптироваться к таким изменениям, большинство организмов выработали механизм, названный внутренними «биологическими часами» и учитывающий смену дня/ночи, чтобы помочь оптимизировать физиологию и поведение живых существ. Этот внутренний ритм известен как циркадный, от латинских слов — «circa» (вокруг) и «dies» (день). Известно, что циркадным ритмам подчинены как одноклеточные цианобактерии и простейшие, так и многоклеточные организмы, включая грибы, растения, насекомых, грызунов и людей.

Строительные блоки циркадной системы состоят из автономного 24-часового генератора ритма или осциллятора, а также настраивающих его механизмов, которые связывают внутренний генератор с внешними стимулами, например, освещенностью, чтобы обеспечить своевременное течение физиологических процессов.

ОТ РИТМОВ К ЧАСАМ

Наблюдения за тем, как организмы приспосабливают свою физиологию и поведение к суточным ритмам, велись давно, взять хотя бы задокументированные данные о наблюдении за движениями цветов и листьев растений. Например, листья мимозы закрываются ночью и открываются при дневном свете. В 1729 г. французский астроном Жан Жак д’Ортуа де Майран (Jean Jacques d’Ortous de Mairan) разместил мимозу в темном помещении и заметил, что листья продолжали открываться и закрываться в соответствующее время суток (рис. 1).

 

Рис. 1
Механизм «биологических часов», гравитационные волны и криогенная микроскопия: Нобелевские лауреаты делают революционные открытия
Подтверждение наличия внутренних «биологических часов» на примере мимозы
©Нобелевский комитет по физиологии или медицине (The Nobel Committee for Physiology or Medicine). Иллюстратор: Маттиас Карлен (Mattias Karlén).

 

Около 200 лет спустя немецкий физиолог-физик и пионер в исследованиях суточного ритма Эрвин Бюнинг (Erwing Bünning) использовал кимограф для фиксации движения листьев растения семейства бобовых в рамках нормального цикла «день/ночь» и при постоянном освещении. Он заметил, что ритм движения листьев сохранялся в обоих случаях. Впоследствии вопрос о том, регулируется ли суточный ритм растений и животных «внутренними часами» или это лишь простая реакция на внешние раздражители, которой присущ суточный характер, будет обсуждаться десятилетиями. В конце концов существование «биологических часов» официально подтвердилось в XX в.

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА «БИОЛОГИЧЕСКИХ ЧАСОВ»

С течением времени многие физиологичес­кие процессы в живых организмах, помимо движений листьев растений, были связаны с «внутренними часами», и наследование циркадных ритмов стало рассматриваться в качестве механизма естественного отбора.

Классические исследования Эрвинга Бюннинга в 1930-х годах показали, что циркадные ритмы в растениях могут быть унаследованы. К середине 1960-х годов сообщество исследователей хронобиологии, изучающих «биологические часы», более детально рассматривало данный механизм, и концепция часов, регулируемых генами, стала предметом для детальных исследований.

Примерно в это же время С. Бензер и Р. Конопка из Калифорнийского технологического института (California Institute of Technology), США, приступили к исследованиям по выявлению мутировавших особей плодовых мушек с измененными циркадными фенотипами.

В отличие от некоторых генетиков и ученых того времени, С. Бензер твердо верил в то, что на поведение живого существа могут влиять отдельные гены. Используя классическую стратегию мутагенеза, С. Бензер и Р. Конопка выделили 3 разных мутировавших особи плодовых мушек и продемонстрировали изменения их суточного ритма. Одна особь была аритмичной, у другой был более короткий суточный период (19 ч), у третьей — наоборот, более длинный суточный период (28 ч). Эксперименты с генетичес­кими маркерами позволили определить, что мутации всех 3 особей были связаны с одним и тем же участком X-хромосомы плодовой мушки. Предполагалось, что мутации затрагивали один и тот же ген, позже названный period. У аритмичной особи экспрессия данного гена подавлялась, а у двух других — каким-то образом подвергалась изменениям.

Более поздние работы ученых указали на то, что их предположения были верны. Со временем С. Бензер сосредоточился на исследованиях в других направлениях, однако Р. Конопка продолжил работу над локусом гена period, с большей точностью отобразив его положение на цитологической карте хромосомы. Однако данный ген не был молекулярно клонирован и секвенирован без совместной работы трех американских ученых Дж. Хола, М. Росбаша и М. Янга. Им впервые удалось выделить и охарактеризовать молекулярную структуру гена «биологических часов». Однако ни идентификация гена period, ни клонирование и секвенирование его комплементарной ДНК не позволило распознать весь молекулярный механизм «биологических часов».

В последующие годы было установлено, что на экспрессию гена period влияет белок PER. Однако как уровень белка PER подвергается циркадным колебаниям? Ученые выявили, что белок PER, кодируемый геном period, накапливается в клетках в течение ночи и деградирует в течение дня. Таким образом, уровень белка PER колеблется в течение 24-часового цикла, синхронно с циркадным ритмом.

Следующая ключевая цель заключалась в том, чтобы понять, как такие циркадные колебания могут возникать и поддерживаться. Д. Холл и М. Росбаш предположили, что белок PER способен блокировать экспрессию гена period при достижении определенной концентрации. Они полагали, что с помощью петлевого механизма обратной связи белок PER может препятствовать собственному синтезу и тем самым регулировать собственный уровень в непрерывном циклическом ритме. Когда ген period активен, происходит синтезирование матричной РНК, которая впоследствии поступает в цитоплазму клетки и служит в качестве матрицы для продуцирования белка PER. Белок PER накапливается в ядре клетки, тем самым блокируя экспрессию гена period. Это приводит к петлевому механизму обратной связи, который лежит в основе циркадного ритма.

Фактически модель была сформулирована, однако некоторые части головоломки отсутствовали. Чтобы блокировать экспрессию гена period, белок PER, который продуцируется в цитоплазме, должен был достигнуть клеточного ядра, где расположен генетический материал. Д. Холл и М. Росбаш показали, что белок PER накапливается в ядре ночью, но как он туда попадает из цитоплазмы? В 1994 г. М. Янг выявил второй ген «биологических часов» — timeless, кодирующий белок TIM. Ученый показал, что, связываясь между собой, белки TIM и PER могут проникать в ядро клетки и блокировать активность гена period. Интересно, что экспрессия гена period была упразднена у особей плодовых мушек с мутацией в гене timeless и, наоборот, у особей с мутацией в гене period нарушалась экспрессия гена timeless. Это укрепило концепцию о петлевом механизме обратной связи в качестве способа авторегуляции «биологических часов» (рис. 2А).

Однако механизм активации транскрипции генов period и timeless все еще оставался неизученным. Этот вопрос был разрешен с открытием генов clock и cycle и белков, регулирующих их экспрессию CLK и CYC, которые способны взаимодействовать друг с другом, а также связываться с элементами генов period и timeless. В последующих исследованиях было показано, что TIM и PER действуют как ингибиторы активности CLK.

Современные модели механизма «внутренних часов» на молекулярном уровне крайне сложны и включают множество дополнительных компонентов, которые в совокупности способствуют его устойчивости и циркадной периодичности. Важно отметить, что поскольку реакции транскрипции и трансляции обычно бывают быстрыми, основной механизм обратной связи должен быть каким-то образом задержан для генерации 24-часовых колебаний. Это достигается сложной сетью реакций с регулируемым фосфорилированием белковых структур и деградацией компонентов данного механизма, образованием белкового комплекса, ядерной транслокацией и другими посттрансляционными модификациями.

Ключевое наблюдение, демонстрирующее основополагающий механизм такой задержки, было получено с помощью открытия М. Янгом гена doubletime, кодирующего киназу DBT, которая фосфорилирует белок PER и повышает его деградацию. Это обес­печило понимание того, как регулируется колебание уровня белка PER на протяжении 24-часового цикла. Другие белки обеспечивают учет сигналов из окружающей среды и также принимают участие в настраивании «внутренних часов» (рис. 2В). Таким образом, открытия нобелевских лауреатов позволили установить ключевые механизмы, контролирующие «биологические часы».

Рис. 2
Механизм «биологических часов», гравитационные волны и криогенная микроскопия: Нобелевские лауреаты делают революционные открытия
Упрощенный механизм обратной связи в гене period. А. Колебание уровня матричной РНК гена period и белка PER с накоплением последнего через несколько часов после достижения пикового значения количества мРНК. PER локализуется в ядре, а активность гена period колеблется в результате его ингибирования белком PER через механизм обратной связи. В. Необходимость дополнительных белков для экспрессии гена period. Уровень белка TIM, кодируемый геном timeless, также колеблется, и TIM взаимодействует с PER. Взаимодействие имеет решающее значение для накопления белка PER в ядре клетки и репрессии гена period. Белок DBT кодируется геном doubletime. DBT представляет собой протеинкиназу, которая фосфорилирует PER, что приводит к его деградации. Это обусловливает задержку накопления мРНК и белка PER. Белки CLK и CYK, закодированные генами clock и cycle, являются 2 факторами транскрипции, которые активируют ген period.
©Нобелевский комитет по физиологии или медицине (The Nobel Committee for Physiology or Medicine). Иллюстратор: Маттиас Карлен (Mattias Karlén)

«БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЧАСЫ» В ДРУГИХ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ

Открытые механизмы являются основополагающим принципом работы «биологических часов» в многоклеточных организмах, включая людей. Несколько гомологов основных белков данного механизма, включая CLK и PER, у плодовых мушек играют аналогичную роль в циркадном хронометре млекопитающих. Хотя растения в основном используют факторы транскрипции, которые негомологичны тем, которые присутствуют в «биологических часах» дрозофил, механизм обратной связи все же является объединяющим основным принципом работы «биологических часов».

Однако у цианобактерий был также описан другой тип циркадного осциллятора внутри клеток, независимого от процессов транскрипции, однако зависимого от последовательных эпизодов фосфорилирования белка. Осциллятор, независимый от процесса транскрипции, также был описан у эукариот, в том числе в эритроцитах человека. Физиологическая значимость подобных колебаний неизвестна. Тем не менее полученные результаты свидетельствуют о том, что в клетках млекопитающих могут существовать дополнительные механизмы генерации циркадных колебаний.

СИНХРОНИЗАЦИЯ ЧАСОВ

Циркадные ритмы регулируются как на центральном, так и на периферическом уровне. У млекопитающих основной регулятор циркадных ритмов расположен в супрахиазматическом ядре (SCN) гипоталамуса и функционирует он как «центральные часы». Сетчатка получает фотосигнал и передает эту информацию в SCN, которая синхронизирует свои собственные нейронные клеточные часы.

«Центральные часы» регулируют циркадные ритмы по всему телу через гуморальные факторы и периферическую вегетативную нервную систему. Однако в большинстве периферических органов и тканей циркадные колебания могут происходить в изоляции от центральных механизмов, то есть на периферическом уровне. Таким образом, в целом циркадная система напоминает скорее «магазин часов», чем одни «часы». Это поставило вопрос о том, как можно эффективно синхронизировать эти механизмы.

ФИЗИКА

Нобелевская премия по физике 2017 г. была присуждена трем ученым — Райнеру Вайссу (Rainer Weiss), Барри К. Баришу (Barry C. Barish) и Кипу С. Торну (Kip S. Thorne) за наблюдение гравитационных волн детектором LIGO (Laser Interferometric Gravitational Observatory).

14 сентября 2015 г. ученым впервые удалось выявить гравитационные волны Вселенной, появление которых было предсказано еще Альбертом Эйнштейном 100 лет назад. Волны произошли от столкновения 2 черных дыр. Потребовалось 1,3 млрд лет, чтобы они дошли до детектора LIGO в США. Сигнал был очень слабым, но когда он достиг Земли, то уже обещал революцию в астрофизике. До сих пор для изучения Вселенной использовались электромагнитные излучения и частицы, такие как космические лучи или нейтрино. Однако гравитационные волны являются прямым свидетельством перебоев в плоскости «пространство-время». Предполагается, что множество открытий ждет тех, кто преуспеет в распознавании гравитационных волн и интерпретации их сообщений.

Проект LIGO, или лазерно-интерферометрической гравитационно-волновой обсерватории, является совместным международным проектом более 1000 исследователей из более чем 20 стран мира.

ХИМИЯ

Лауреатами Нобелевской премии по химии 2017 г. стали Жак Дюбоше (Jacques Dubochet), Иоахим Франк (Joachim Frank) и Ричард Хендерсон (Richard Henderson) за разработку крио­электронной микроскопии, которая упрощает и улучшает визуализацию молекул биологического материала. Этот метод переместил биохимию в новую эру.

Научные прорывы часто основываются на успешной визуа­лизации объектов, невидимых для человеческого глаза. Однако доступные технологии не позволяли получить четкую картинку многих молекулярных механизмов. Криоэлектронная микроскопия изменила это. Исследователи теперь могут заморозить молекулы биологического материала в процессе их движения и визуализировать процессы, которые они никогда ранее не видели, что является решающим как для базового понимания «химии» жизни, так и для разработки инноваций в сфере фармации.

Электронные микроскопы длительное время считались пригодными для визуализации «мертвых» образцов, поскольку мощный электронный пучок разрушал биологический материал. Но в 1990 г. Р. Хендерсону удалось использовать электронный микроскоп для создания трехмерного изображения белка с разрешением на атомном уровне. Этот прорыв доказал потенциал технологии.

И. Франк сделал эту технологию более доступной. В период 1975–1986 гг. он разработал метод обработки изображений, в котором нечеткие двухмерные изображения электронного микро­с­копа анализируются и сливаются, чтобы выявить трехмерную структуру анализируемого образца.

Ж. Дюбоше использовал воду в электронной микроскопии. Вода испарялась в вакууме электронного микроскопа, что приводило к разрушению молекул биологического материала. В начале 1980-х годов ученому удалось добиться стеклоподобного состоя­ния воды — он так быстро охлаждал ее, что она затвердевала вокруг биологического образца, позволяя молекулам сохранять свою естественную форму даже в вакууме.

После этих открытий были оптимизированы все детали элект­ронного микроскопа. Нужное разрешение на атомном уровне было получено в 2013 г., и теперь исследователи могут создавать трехмерные структуры молекул биологического материала. За последние несколько лет удалось получить изображения различных образцов от изображений белков, которые вызывают устойчивость к антибиотикам, до наружной оболочки вируса Зика.

ЛИТЕРАТУРА

Нобелевскую премию по литературе 2017 г. вручили британскому писателю японского происхождения — Казуо Исигуро (Kazuo Ishiguro), «который в романах необыкновенной эмоциональной силы раскрыл пропасть под нашим иллюзорным ощущением связи с миром».

ПРЕМИЯ МИРА

Премия мира, в отличие от премий в других областях, может присуждаться как отдельным лицам, так и официальным и общественным организациям. Так, Нобелевская премия мира 2017 г. была присуждена Международной кампании за уничтожение ядерного оружия (International Campaign to Abolish Nuclear Weapons — ICAN) за работу, направленную на привлечение внимания к катастрофическим гуманитарным последствиям любого применения ядерного оружия, а также за ее новаторские усилия по достижению запрета на такое оружие на основе договоров.

Ядерное оружие представляет собой постоянную угрозу для человечества и всей жизни на земле. Благодаря обязательным международным соглашениям международное сообщество ранее принимало запреты на использование наземных мин, кассетных боеприпасов, биологического и химического оружия. Ядерное оружие еще более разрушительно, однако пока не стало объектом аналогичного международного запрета. Благодаря своей работе ICAN помогла заполнить этот правовой пробел. Важным аргументом в обосновании запрета ядерного оружия является «неприемлемое человеческое страдание», которое вызовет ядерная война. ICAN является коалицией неправительственных организаций из примерно 100 стран мира. Коалиция стала движущей силой для стран, которые обязались сотрудничать со всеми заинтересованными сторонами в отношении усилий по стигматизации, запрещению и ликвидации ядерного оружия. На сегодня 108 государств взяли на себя такое Гуманитарное обязательство (Humanitarian Pledge).

Кроме того, ICAN является ведущей организацией относительно стремления добиться запрета ядерного оружия в соответствии с международным правом. 7 июля 2017 г. 122 государства — члена ООН поддержали подписание Договора о запрещении ядерного оружия. Как только договор будет ратифицирован 50 государствами, запрет на ядерное оружие вступит в силу и станет обязательным к исполнению в соответствии с международным правом для всех стран, которые подписали этот договор.

Норвежский Нобелевский комитет осознает, что международный правовой запрет сам по себе не устранит угрозу ядерного оружия и что до сих пор ни государства, которые уже имеют ядерное оружие, ни их ближайшие союзники, не поддерживают Договор о запрещении ядерного оружия. Комитет хотел бы подчеркнуть, что следующие шаги по достижению мира, свободного от ядерного оружия, должны включать поддержку данной инициативы государствами, обладающими ядерным оружием. Поэтому в этом году Премия мира также призывает эти государства начать переговоры в целях постепенной, сбалансированной и тщательно контролируемой ликвидации почти 15 тыс. единиц ядерного оружия в мире. Из всех государств, которые в настоящее время имеют ядерное оружие, только 5 — США, Россия, Великобритания, Франция и Китай — уже поставили для себя такую задачу благодаря их поддержке Договора о нераспространении ядерного оружия 1970 г. Данный договор останется основным международно-правовым документом для содействия ядерному разоружению и предотвращения дальнейшего распространения такого оружия.

Прошел уже 71 год с тех пор, как Генеральная ассамблея ООН в своей первой резолюции высказалась относительно важности ядерного разоружения и установления мира, свободного от ядерного оружия. Благодаря присуждению Нобелевской премии ICAN норвежский Нобелевский комитет хотел воздать должное организации за то, что она дала новый импульс усилиям по достижению этой цели. ICAN в большей степени, чем кто-либо другой, в прошлом году приложила усилия для достижения мира без ядерного оружия.

ЭКОНОМИЧЕСКИЕ НАУКИ

Премия в области экономических наук памяти Альфреда Нобеля была вручена Ричарду Х. Талеру (Richard H. Thaler) за его вклад в поведенческую экономику. Ученому удалось интегрировать экономику с психологией, то есть провести анализ того, как психологические аспекты влияют на принятие экономических решений. Он показал, как такие черты, как ограниченная рацио­нальность, социальные предпочтения и отсутствие самоконтроля, характерные для человека, систематически влияют на принятие решений, а также каким образом это отражается на экономических результатах.

В общей сложности вклад Р. Талера создал «мост» между экономическим и психологическим анализом принятия решений. Его эмпирические выводы и теоретические идеи сыграли важную роль в создании новой и быстро расширяющейся области поведенческой экономики, которая оказала глубокое влияние на многие сферы экономических исследований и политики.

«Периферические часы» могут синхронизироваться как посредством SCN, так и с помощью других сигналов, обусловленных употреб­лением пищи, физической активностью и температурой. Они контролируют соответствующие физиологические процессы в разных тканях, такие как производство глюкозы, хранение жира и высвобождение гормонов. «Периферические часы» обеспечивают контрольные сигналы для «часов» в тканях по всему телу, в конечном счете синхронизируясь с центральным механизмом в SCN.

Отношения между «центральными» и «периферическими часами» и многочисленные способы их воздействия с помощью внутренних и внешних сигналов — это активная область исследований, открытая для новых изобретений.

ЦИРКАДНЫЕ РИТМЫ И ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА

Хронобиология влияет на многие аспекты физиологии человека. Так, например, «биологические часы» помогают регулировать цикл «сон/бодрствование», пищевое поведение, высвобождение гормонов, артериальное давление и температуру тела (рис. 3).

Рис. 3
Механизм «биологических часов», гравитационные волны и криогенная микроскопия: Нобелевские лауреаты делают революционные открытия
«Биологические часы» приспосабливают физиологию человека ко времени суток.
©Нобелевский комитет по физиологии или медицине (The Nobel Committee for Physiology or Medicine). Иллюстратор: Маттиас Карлен (Mattias Karlén)

Они также играют критическую роль на локальном уровне во многих тканях. Абляция генов «биологических часов» на животных моделях привела к аритмическому производству гормонов, таких как кортикостерон и инсулин. Гены «часов» также оказывают значительное влияние на метаболизм посредством контроля глюконео­генеза, чувствительности к инсулину и системных колебаний уровня глюкозы в крови.

Сон жизненно необходим для нормальной функции головного мозга, а циркадная дисфункция связана с расстройствами сна, а также с депрессией, биполярным расстройством, когнитивными нарушениями и некоторыми нейрологическими заболеваниями. В редких случаях расстройства фазы сна связаны с мутациями в генах «биологических часов», что приводит к нарушению цикла «сон/бодрствование» (его укорочению или удлинению).

Исследования также показали, что хроническое несоответствие образа жизни и ритма, продиктованного «биологическими часами», может быть связано с повышенным риском развития различных заболеваний, включая онкопатологию, нейродегенеративные заболевания, нарушения обмена веществ и воспалительные процессы.

Предпринимаются усилия по разработке подходов в хронобиологии и фармакологии для изменения периода, фазы или амплитуды «биологических часов» для улучшения здоровья человека. Благодаря открытию Нобелевских лауреатов циркадная биология превратилась в обширную и динамично развивающуюся область исследований, что потенциально может иметь важные последствия для здоровья и благополучия человека в будущем.

Светлана Шелепко,
по материалам
© The Nobel Committee for Physiology or Medicine;
фото и иллюстрации
© The Nobel Committee for Physiology or Medicine

Комментарии

Нет комментариев к этому материалу. Прокомментируйте первым

Добавить свой

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*