Борцы с догмами
8 октября Нобелевская ассоциация Каролинского института, Стокгольм, огласила обладателей Нобелевской премии за 2012 г. по физиологии и медицине. Ее обладателями стали профессор Кембриджского университета Джон Б. Гердон (John B. Gurdon) и профессор университета Киото Синья Яманака (Shinya Yamanaka), которым удалось опровергнуть господствовавший до недавнего времени в биологии индивидуального развития тезис о необратимости клеточной дифференциации.
В 1962 г. Дж. Гердон, в ставшем впоследствии классическим эксперименте заменил ядро яйцеклетки лягушки ядром дифференцированной клетки кишечника. Модифицированная яйцеклетка развилась в нормального головастика. Это доказало факт, что в генетическом материале дифференцированной зрелой клетки сохраняется вся информация, необходимая для развития целого организма.
Первоначально открытие Дж. Гердона было встречено со скептицизмом, но в скором времени его результаты были повторены другими исследователями. Это положило начало исследованиям, которые в конечном итоге привели к клонированию млекопитающих. Однако в эксперименте Дж. Гердона ядро зрелой клетки при помощи микроманипуляций помещалось в цитоплазму зародышевой клетки. Долгие годы был открыт вопрос, можно ли вернуть в стволовое состояние интактную дифференцированную клетку.
На этот вопрос смог ответить Синья Яманака. Свое исследование он проводил на культуре in vitro стволовых клеток мышей, изолированных Мартином Эвансом (Martin Evans; Нобелевская премия 2007 г.). С. Яманаке удалось найти ряд генов, которые сохраняли клетки в недифференцированном состоянии. Когда некоторые из этих генов были расшифрованы, он попытался использовать их для возвращения зрелой клетки в плюрипотентное состояние. С. Яманака с сотрудниками перебрали ряд комбинаций генов, которые они вводили в фибробласты соединительной ткани. В результате была найдена комбинация 4 генов, способная превращать фибробласты в стволовые клетки.
Предыстория успеха
На протяжении многих лет у эмбриологов даже не вызывало сомнения, что процесс дифференциации клеток — это «билет в один конец». Казалось бы, идея об обратимости процесса клеточной дифференциации попросту противоречит здравому смыслу — неизвестно о случаях, когда у высокоразвитых животных зрелая клетка изменила бы свою специализацию, либо возвратилась к недифференцированному состоянию. К тому же, в 1950-е годы, когда зарождалась молекулярная биология, стало известно, что для каждого типа клеток характерны свои белковые паттерны. Это дало возможность предполагать, что при дифференциации клеток происходят необратимые генетические либо эпигенетические изменения, что делает невозможным изменение дифференциации.
Догма была настолько непоколебима, что один из основателей эпигенетики, Конрад Хэл Уоддингтон (Conrad Waddington) предложил для описания эпигенетических изменений при дифференциации клетки метафорическую картину горных пиков и долин. На самой вершине находятся «голые камни» — плюрипотентные клетки, которые затем скатываются все ниже, пока не займут свое место в долинах. И как невозможно отколовшийся кусок скалы вернуть на вершину, так невозможно дифференцированную клетку вернуть в первоначальное состояние.
Впрочем, уже в те времена находились скептики, усомнившиеся в незыблемости представлений о необратимости клеточной дифференциации. Так, еще в 1930-е годы Ганс Шпеман (Hans Spemann, Нобелевская премия по физиологии и медицине 1935 г.) выдвинул идею эксперимента, в котором ядро зрелой дифференцированной клетки будет пересажено в цитоплазму зародышевой клетки. Впрочем, в те времена, подобный эксперимент был технически неосуществим, поэтому сам Г. Шпеман называл свою идею фантастикой.
Впервые попытка проверить, обладают ли дифференцированные соматические клетки скрытым потенциалом плюрипотентности, была предпринята в 1952 г. Робертом Бриггсом (Robert Briggs) и Томасом Кингом (Thomas King), которые разработали технологию пересадки ядра соматической клетки в оплодотворенную яйцеклетку леопардовой лягушки (Rana pipiens). (Впоследствии амфибии стали классическим материалом для подобного рода экспериментов по причине большого размера яйца и внешнего развития эмбрионов).
В своем исследовании Бриггс и Кинг показали, что при трансплантации ядра эмбриональной клетки в цитоплазму яйцеклетки получается вырастить нормальных головастиков. Однако, при проведении подобной процедуры с ядрами взрослых дифференцированных клеток они не получили развивающихся эмбрионов. Таким образом, исследователи пришли к заключению, что дифференцированные ядра претерпевают необратимые изменения во время дифференцирования, и плюрипотентный потенциал у них необратимо утерян.
Несмотря на то что, казалось, уже расставлены все точки над «i», молодой эмбриолог Дж. Гердон решил повторить эксперимент Бриггса и Кинга. Правда, в качестве модели им была избрана не леопардовая лягушка, а гладкая шпорцевая лягушка (Xenopus laevis). Кроме того, в отличие от Бриггса и Кинга, нативное ядро уничтожали не при помощи механических манипуляций, а облучением ультрафиолетом. Хотя большая часть трансплантатов погибала, после пересадки в подготовленные яйцеклетки ядра эпителия кишечника Дж. Гердон получил нескольких полноценных головастиков. Затем он установил, что доля развивающихся эмбрионов может быть существенно увеличена, если производить последовательные серии трансплантаций ядра. В последующие годы Дж. Гердон варьировал свой эксперимент, пересаживая ядра из клеток разных типов тканей, а также заменял одно из ядер многоклеточного эмбриона на разных стадиях дифференцирования ядром взрослой клетки. Во всех этих случаях он получал нормальных головастиков.
Впрочем, несмотря на очевидные результаты Дж. Гердона, догма о необратимости дифференциации оказалась настолько сильна, что научное сообщество пыталось оспорить его результаты в течение многих лет.
Достойное признание научного сообщества исследования Дж. Гердона получили лишь в 1987 г., когда Рональд Девис (Ronald Davis) и др., используя технику Дж. Гердона, вырастили из фибробластов мыши культуру миобластов, доказав, что плюрипотентным потенциалом обладают не только дифференцированные клетки амфибий, но и млекопитающих. Это был первый шаг к клонированию.
От лягушек к овцам
Открытие Дж. Гердона положило начало направлению масштабной области исследований по трансферу ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer — SCNT), позволивших понять механизмы дифференциации и клеточной специализации. В 1997 г. Иэном Вильмутом (Ian Wilmut) и Китом Кэмпбеллом (Keith Campbell) был получен первый впечатляющий результат — рождение овцы Долли в результате SCNT из клетки эпителия молочных желез в яйцеклетку.
Стратегия эксперимента И. Вильмута и К. Кэмпбелла была основана на методике Дж. Гердона с амфибиями с рядом модификаций. Со времени рождения Долли в 1997 г. при помощи SCNT-методики были получены клоны множества многих видов млекопитающих, включая мышь, корову, свинью, волка и крупных кошачьих. В 2002 г. были получены мыши, клонированные из ядра B- и Т-лимфоцитов. Это неопровержимо доказало, что даже столь высокоспециализированные клетки, в течение жизни приобретающие существенные эпигенетические изменения, обусловленные необходимостью выработки специализированных иммуноглобулинов, несут в себе потенциал для развития полноценного организма.
Дальнейшее развитие исследований в области плюрипотентности связано с работами С. Яманаки. Его лаборатория сосредоточилась на факторах, необходимых для поддержания плюрипотентности в стволовых эмбриотических клетках. В результате С. Яманаки с сотрудниками удалось идентифицировать ген плюрипотентности Nanog, а также 24 транскрипционных фактора, присутствующих в стволовых клетках и предположительно имеющих отношение к поддержанию плюрипотентности. Также лабораторией С. Яманаки было установлено, что слияние цитоплазмы стволовых и соматических клеток вызывает возвращение последних к плюрипотентному состоянию.
Затем С. Яманаки были расшифрованы генетические последовательности, кодирующие открытые им факторы транскрипции, имеющие отношение к плюрипотентности, и проведен эксперимент, в котором данные 24 гена при помощи ретровиральных векторов совместно вводили в фибробласты кожи. В некоторых случаях фибробласты образовывали колонии, напоминающие культуру стволовых клеток. Впоследствии С. Яманаки с сотрудниками удаляли ряд генов в разных комбинациях.
Таким образом, количество факторов транскрипции, необходимых для возврата дифференцированных клеток в состояние плюрипотентных стволовых клеток, было сокращено до 4 (Myc, Oct3/4, Sox2 и Klf4). Полученные подобным образом клетки были названы С. Яманаки индуцированными стволовыми плюрипотентными клетками (induced pluripotent stem cells — iPS cells).
В первоначальных экспериментах iPS-клетки появлялись с очень низкой частотой. Однако, введя в геном мышей, которых использовали для получения iPS-клеток, ген устойчивости к неомицину, удалось получить культуру таких клеток. (Экспрессия этого гена активировалась лишь в iPS-клетках, но не в дифференцированных, соответственно, iPS-клетки приобретали устойчивость к данному антибиотику).
Полученные iPS-клетки вводили в бластоцисту химерных мышей (метод получения лабораторных животных, при котором in vitro выращивают эмбрионы до стадии 8 бластомеров, затем агрегируют клетки эмбрионов от разных доноров и выращивают in vitro эмбрион до стадии бластоцисты, после чего подсаживают в матку). В результате наблюдали развитие многочисленных видов тератом.
Тем не менее, в первом исследовании С. Яманаки не удалось получить стабильную культуру iPS-клеток. Эта задача была достигнута год спустя, в 2007 г., когда группе С. Яманаки, параллельно с группами Рудольфа Джэениша (Rudolf Jaenisch — один из пионеров клонирования) и Конрада Хохедлингера (Konrad Hochedlinger), удалось усовершенствовать систему отбора, и они смогли создать стабильную линию iPS-клеток. В том же году параллельно лабораториям С. Яманаки и Джеймса Томсона (James Thomson) удалось впервые получить iPS-клетки человека. При этом С. Яманака были использованы гены тех же 4 факторов транскрипции, что и при экспериментах на мышах (Myc, Oct4, Sox2 и Klf4), тогда как Дж. Томсон использовал несколько отличную комбинацию транскрипционных факторов (Lin28, Nanog, Oct4 и Sox2).
Будни житейские
За прошедшие со времени первых экспериментов С. Яманаки годы, технология получения iPS-клеток была значительно улучшена. К примеру, удалось разработать способ доставки в клетку генетического материала, кодирующего транскрипционные факторы плюрипотентности без использования ретровиральных векторов, которые беспорядочно интегрируются в геном и по этой причине способны повредить близлежащие эндогенные гены, что может вызвать развитие опухолей.
В наши дни для интеграции генетического материала используют вирусные векторы, не встраивающиеся в хромосомы, либо эписомальные плазмиды (генетический материал, стабилизированный белками или РНК). Кроме того, было доказано, что для превращения некоторых типов тканей в iPS-клетки можно ограничить количество транскрипционных факторов (например для превращения в в iPS-клетки нейрональных стволовых клеток мыши достаточно введения лишь одного фактора Oct4).
Сделанное Дж. Гердоном и С. Яманака открытие дало новый импульс исследованиям в области трансдифференцировки — непосредственному превращению одного типа клеток в другой, миновав стадию iPS-клеток.
Эти исследования были начаты еще в 1960-е годы в экспериментах с имагинальным диском дрозофилы (зачаток будущего органа в личинках и куколках насекомых, имеющий форму диска и состоящий из нескольких слоев довольно однородных эпителиальных клеток, расположенных вокруг узкого просвета). В то время удалось превратить фибробласты в миобласты при помощи активации единственного гена (который был назван MyoD).
Однако лишь после исследований С. Яманаки, модифицируя его методику поиска транскрипционных факторов, ответственных за дифференциацию, удалось получать стабильные результаты. Так, была показана возможность превращения экзокринных клеток поджелудочной железы в эндокринные, а фибробластов — в кардиомиоциты. Также была продемонстрирована возможность изменения дифференциации тканей, развивающихся даже из разных зародышевых листков: так, из фибробластов (мезодерма) были получены нейробласты (эктодерма). В текущем году появились первые данные об успешном изменении трансдифференцировки клеток млекопитающих in vivo.
С применением стволовых клеток, как и с возможностями трансфифференцировки, связаны определенные надежды фармацевтов и врачей. iPS-клетки гипотетически могут быть использованы для замены больных или недостающих клеток при ряде дегенеративных заболеваний, например болезни Паркинсона или сахарном диабете I типа. Также возможность «выращивания» из iPS-клеток тканей и органов поможет преодолеть проблему иммунного отторжения при трансплантациях. Впрочем, практическое использование iPS-клеток — дело будущего. Чтобы подобные методики нашли применение в клинической практике, требуется значительно улучшить и удешевить методики выращивания iPS-клеток.
Также вызывают вопросы проблемы безопасности. Применяемые в настоящее время для получения iPS-клеток процедуры потенциально могут вызвать мутации и другие генетические нарушения, что ограничивает использование iPS-клеток для терапии. Одним словом, хотя применение iPS-клеток в медицине открывает фантастические горизонты, требуются дальнейшие исследования для доказательства безопасности этого метода терапии.
Другая, гораздо более реалистичная перспектива — исследование ряда генетических заболеваний и болезней с генетической предрасположенностью. Получив от пациентов культуру iPS-клеток, можно лучше понять процессы, вызывающие болезнь, а также проводить на этих культурах токсикологические исследования новых лекарственных средств. В настоящее время уже получены культуры iPS-клеток от пациентов с амиотрофическим латеральным склерозом, синдромом Ретта, спинальной мышечной атрофией, недостаточностью антитрипсина α1, семейной гиперхолестеринемией и болезнью Гирке (гликогеноз I типа с дефектом глюкозо-6-фосфатазы).
Уже сейчас культуры iPS-клеток используются в исследованиях в области кардиологии для изучения синдрома удлиненного интервала Q–T I и II типов.
Также на iPS-клеточных моделях заболеваний были выявлены связи между фенотипом клеточной культуры и болезнью. К примеру, у нейробластов, выращенных из iPS-клеток, полученных от больных амиотрофическим латеральным склерозом, отмечается прогрессивное уменьшение подвижности, а у нейробластов из iPS-клеток, полученных от больных синдромом Ретта, было выявлено уменьшение размеров дендритных шипиков (мембранных выростов, способных образовывать синаптические соединения). Гепатоциты, полученные из iPS-клеток больных болезнью Гирке, показали избыточное накопление гликогена и жиров.
Выявленная закономерность позволяет предполагать, что культуры iPS-клеток могут быть успешно использованы для моделирования болезней с поздним развитием, таких как болезнь Альцгеймера, спиноцеребральная атаксия и болезнь Хантингтона.
Также определенный прогресс был достигнут при изучении заболеваний со сложной генетикой, например, шизофрении.
При исследовании iPS-клеточной модели семейной дизавтономии было найдено новое активное вещество, названное кинетин (kinetin), которое частично обращает нарушение сплайсинга гена IKBKAP (что и вызывает болезнь). Также на iPS-клеточной модели была доказана нормализация фенотипа клеток при назначении блокаторов бета-адренорецепторов и блокаторов ионных каналов при синдроме удлинения интервала Q–T.
Таким образом, сделанное Дж. Гердоном и С. Яманака открытие уже прочно вошло если не в клиническую, то в лабораторную практику. Культуры iPS-клеток и успешно используются в качестве скрининговых платформ для разработки и тестирования новых лекарственных средств.
Впрочем, это лишь начало большого пути. Пути, который показывает для науки открытие, доказавшее возможность возврата зрелых клеток в их эмбриональное детство.
Коментарі