Стволовые клетки ? наша новая Вавилонская башня?

Библейская притча о Вавилонской башне имеет много общего, ассоциативного и аллегоричного не только с современной цивилизацией, но и с новейшими достижениями науки, в том числе в области биологии, генетики, медицины. Эволюция, бурное развитие науки, в частности медицинской, не только расширяют наши возможности и позволяют человечеству укрепить свое здоровье, увеличить продолжительность и качество жизни, но и ставят множество новых трудноразрешимых задач, которые с каждым разом становятся все более и более запутанными и многогранными. Параллельно со своим развитием медицина сталкивается со все бо льшим числом не только сугубо специализированных, но и сложных смежных проблем этического и юридического плана. Вопрос получения и использования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) ? один из таких.

Как 20 лет тому назад вопрос клонирования или искусственного оплодотворения, тема ЭСК сегодня ? одна из наиболее обсуждаемых и полемических. В некоторых странах блокируют всяческую возможность исследования подобных тем, в других пытаются законодательно регулировать их, в третьих существуют различные предпосылки к спекулированию данной темой. Безусловно, этим материалом мы не сможем расставить все по углам. Скорее, даже наоборот ? зародим множество сомнений, что, возможно, подтолкнет многих к более внимательному и критичному отношению к этой теме: всё знают, когда ничего не знают, ? со знанием приходит сомнение…

Что такое стволовые клетки?

Стволовые клетки — это клетки, обнаруженные у большинства многоклеточных организмов, для которых характерной особенностью является их способность к самовоспроизведению с дальнейшей дифференциацией в различные типы специализированных клеток. Стволовые клетки, считают исследователи, могут помочь восполнить недостаток других клеток, которые были повреждены в результате заболевания, травмы или естественного износа. При делении стволовой клетки каждая новая клетка получает возможность либо остаться стволовой, либо же превратиться в клетку другого типа, обладающую более специализированными функциями, как, например, нервные клетки, клетки кожи или красные кровяные тельца…

Сам термин «стволовая клетка» был введен в научный обиход русским гистологом Александром Максимовым (1874–1928), который постулировал существование стволовой кроветворной клетки. На заседании Общества гематологов в Берлине 1 июня 1909 г. он ввел понятие «stammzelle» (нем.), подразумевая под этим определением лимфоцит в более широком значении слова как клетку, способную быть стволовой в современном понимании (Maximow A., 1909). Исследования же в области изучения стволовых клеток возникли как следствие работ канадских ученых — Эрнеста МакКуллоха (Ernest A. McCulloch) и Джеймса Тилла (James E. Till) в 1960-х годах, а затем и Дональда Меткалфа (Donald Metcalf) с сотрудниками в 1970-х годах (Becker A.J., McCulloch E.A., Till J.E., 1963 ; Siminovitch L., McCulloch E.A., Till J.E., 1963 ; Metcalf D., Moore M.A.S., 1971). В результате этих исследований были обнаружены два типа стволовых клеток млекопитающих: эмбриональные стволовые клетки (еmbryonic stem cells — ES cells), которые были выделены из внутренней клеточной массы на ранней стадии развития зародыша — бластоциста, и взрослые стволовые клетки (adult stem cells), которые найдены во взрослых тканях. В развивающемся эмбрионе стволовые клетки могут дифференцироваться во все специализированные эмбриональные ткани. Во взрослых организмах стволовые клетки и клетки-предшественники (progenitor cells) выступают в качестве регенеративной системы, пополняя количество специализированных клеток, а также поддерживая нормальный обмен регенеративных органов, таких как кровь, кожа или ткани кишечника. Позже была получена третья разновидность стволовых клеток — индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (induced pluripotent stem cells — iPSC или iPS), которые удалось получить из клеток различных тканей (в первую очередь фибробластов) с помощью их перепрограммирования методами генной инженерии. В 1981 г. ЭСК впервые были независимо получены из эмбрионов мыши двумя группами ученых, возглавляемыми Мартином Эвансом (Martin Evans) и Мэтью Коуфманом (Matthew Kaufman) из отдела генетики Кембриджского университета (Department of Genetics, University of Cambridge), которые впервые опубликовали результаты своих исследований в июле 1981 г. в журнале «Nature» (Evans M., Kaufman M., 1981). Гэйл Мартин (Gail R. Martin) из отдела анатомии Университета Калифорнии (University of California; Сан-Франциско) опубликовала свою работу в декабре того же года и ввела термин «эмбриональная стволовая клетка» (Martin G., 1981 ). Она показала, что эмбрионы могут быть культивированы in vitro и что ЭСК могут быть получены из этих эмбрионов. Почти 20 лет спустя, в 1998 г., произошел прорыв, когда исследователи во главе с Джеймсом Томсоном (James Thomson) из Университета Висконсин-Мэдисон (University of Wisconsin-Madison) первыми разработали технику по выделению и культивированию человеческих ЭСК (human embryonic stem cells — h-ES cells) в клеточной культуре (Thomson J., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. et al., 1998).

Все эти разновидности стволовых клеток обладают такими свойствами, как способность к продолжительному выживанию, делению и само­воспроизведению, а также отсутствие у них какой-либо специализации («tabula rasa») и способность впоследствии развиваться в специализированные типы клеток (Friedenstein A.J. et al., 1974; Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N., 1976; www.fda.gov).

ЭСК являются плюрипотентными стволовыми клетками, то есть способными дифференцироваться во все типы (все три типа зародышевых листков — эктодерму, эндодерму и мезодерму) (Ying Q.L., Nichols J., Chambers I. et al., 2003). Их получают из внутренней клеточной массы бластоциста, или эмбриона на самой ранней стадии его развития (Thomson et. аl., 1998). Человеческие эмбрионы достигают стадии бластоциста на 4–5-е сутки после оплодотворения и состоят из 50–150 ячеек. Плюрипотентность отличает ЭСК от взрослых стволовых клеток; в то время как ЭСК могут генерировать все типы клеток в теле, взрослые стволовые клетки являются мультипотентными и могут генерировать только ограниченное количество типов клеток. Дополнительно, при определенных условиях, ЭСК способны делиться бесконечное число раз. Это позволяет ЭСК использовать в качестве полезных инструментов как для исследований, так и в регенеративной медицине, потому как они способны генерировать безграничное количество себе подобных клеток с целью продолжительного исследования или применения в клинике, о чем речь пойдет немного ниже.

Вместе с тем с обнаружением и выделением стволовых клеток возник ряд вопросов этического характера. Отчасти причиной этого является то, что большинство известных способов извлечения стволовых клеток сопровождается деструктивными действиями. Правда, к настоящему времени было разработано еще несколько источников их получения. Так, 23 августа 2006 г. в онлайн-выпуске журнала «Nature» было опубликовано письмо д-ра Роберта Лэнза (Robert Lanza), медицинского директора компании «Advanced Cell Technology Inc.» (Вустер, Массачусетс), в котором он заявил, что его команда нашла способ извлечения ЭСК, позволяющий избежать деструкции эмбриона (Klimanskaya I., Chung Y., Becker S. et al., 2006). Отчасти это может снять некоторые этические вопросы, равно как и вопросы получения стволовых клеток из костного мозга, пуповинной крови, кожи и пр. Например, 16 января 2008 г. калифорнийская биотехнологическая компания «Stemagen Corp.» объявила о создании первых нескольких эмбрионов, выросших до стадии бластоциста из единичных клеток кожи, взятых у взрослых индивидов (www.stemagen.com; news.bbc.co.uk; www.geneticsandsociety.org). Кроме этого, в настоящее время большое внимание уделяется извлечению ЭСК из так называемых лишних бластоцистов, по тем или иным причинам невостребованным, но приготовленным с целью экстракорпорального оплодотворения.

В то же время с использованием стволовых клеток в терапии заболеваний, кроме этических, существует еще и ряд технических проблем, как, например, реакция «трансплантат против хозяина» (graft-versus-host disease — GVHD), связанная с аллогенной трансплантацией стволовых клеток (allogeneic stem cell transplantation). Однако эти вопросы, связанные с тканевой совместимостью, могут быть решены путем использования стволовых клеток, взятых у той же самой взрослой особи (аутоло­гическое донорство), путем терапевтического клонирования, хранения стволовых клеток пуповинной крови в специальных криобанках или же перепрограммирования соматических клеток (например получение iPSC).


Питер Брейгель Старший, «Вавилонская башня», 1563 г. (Музей истории искусств; Вена, Австрия)

В настоящее время продолжаются также исследования по снижению вероятности отторжения дифференцированных клеток, полученных из ЭСК. Одна из возможностей предотвратить такое отторжение — это создать ЭСК, генетически идентичные пациенту, которому их подсаживают. Это возможно посредством терапевтического клонирования — пересадки ядер соматических клеток, при которой из яйцеклетки (ооцита) изымают ядро и заменяют ядром с ДНК реципиента. После многих митотических делений культуры данная клетка образует бластоцист (раннюю стадию эмбриона, состоящую из приблизительно 100 клеток) с ДНК, почти идентичной таковой у реципиента. В ноябре 2008 г. в журнале «Science» группа американских ученых из Гарвардского института стволовых клеток (Harvard Stem Cell Institute) во главе с Конрадом Хохедлингером (Konrad Hochedlinger) разработала новый метод получения стволовых клеток, который предполагает преобразование соматической клетки в стволовую с помощью аденовирусных векторов (Stadtfeld M., Nagaya M., Utikal J. et al., 2008). Несмотря на то что аденовирусные векторы имеют очень низкую эффективность перепрограммирования клеток (при ретровирусном переносе 0,01–0,1%, при аденовирусном — 0,0001–0,001%), у метода есть несколько важнейших преимуществ: отсутствие раковых новообразований (как в случае применения ретровирусного вектора), отсутствие вирусных вставок и потому идентичность геному эмбриональной клетки.

Это позволяет проводить исследование эффективности терапии с помощью стволовых клеток, например, возрастной макулопатии, при которой погибшие клетки макулы (колбочки, ответственные за цветное зрение и различение мелких деталей) планируется заменять в ходе хирургической операции новыми клетками, выращенными из ЭСК. По мнению исследователей из Института офтальмологии Университетского колледжа Лондона (Institute of Ophthalmology University College London) и лондонской офтальмологической больницы Мурфилдс (Moorfields eye hospital), через 6–7 лет подобная операция может стать рутинной и будет продолжаться около часа (www.timesonline.co.uk ).

Использование стволовых клеток вне эксперимента, кроме отторжения, может быть связано с еще одной проблемой — загрязнением этих клеток реактивами, используемыми для их выращивания в клеточной культуре. Так, в онлайн-выпуске журнала «Nature Medicine», опубликованном 24 января 2005 г., появилась статья, в которой отмечалось, что человеческие ЭСК из Центра научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ (Federally Funded Research and Development Centers — FFRDCs) контаминированны частицами молекул животного происхождения, попавшими из среды, применяемой для культивирования клеток, которые используются для поддержания плюрипотентности активно делящихся клеток. Это порождает ряд проблем; в частности, оказалось, что сиаловая кислота животного происхождения, как считают ученые из Калифорнийского университета (University of California, Сан-Диего), сужает возможности применения ЭСК с терапевтической целью (www.nature.com; Ebert J., 2005; Martin M.J., Muotri A., Gage F. et al., 2005). Однако результаты исследования, опубликованные 8 марта 2005 г. в онлайн-версии журнала «The Lancet», продемонстрировали возможность создания новой линии стволовых клеток, полученных из человеческих эмбрионов в условиях, лишенных клеток или сыворотки животного происхождения. После более чем 6 мес недифференцированной пролиферации эти клетки продемонстрировали способность к формированию производных всех трех зародышевых листков как in vitro, так и в тератоме. Эти свойства были также успешно закреплены (для более чем 30 пассажей) в линиях стволовых клеток (Klimanskaya I., Chung Y., Meisner L. et al., 2005).

Перемен, мы ждем перемен

Однако кроме этических и биологических проблем, перед исследователями возникает также ряд юридических вопросов. Так, в Японии, Сингапуре, Израиле и Корее разрешены исследования в области клонирования стволовых клеток; в Великобритании терапевтическое клонирование разрешено в научно-исследовательских целях и включено в Акт об оплодотворении и клонировании человека (Human Fertilization and Embryology Act) в 2001 г. (Andy Coghlan, 2001; 2006; www.hfea.gov.uk; www.opsi.gov.uk). Во многих странах Европейского Союза законов по поводу стволовых клеток нет вообще, там же, где они есть, их диапазон — от абсолютного запрета исследований (Франция, Германия, Ирландия) до разрешения создавать эмбрионы в исследовательских целях (Великобритания). Бельгия и Нидерланды проводят исследования на эмбрионах при отсутствии законодательных рамок. Исследования запрещены в Австрии, Германии и во Франции, но последняя позволяет «изучение эмбрионов без нанесения ущерба их целостности» и преимплантационную диагностику. Испанская конституция предлагает защиту только для жизнеспособных эмбрионов in vitro, причем критерии жизнеспособности не распространяются на лишние эмбрионы, образующиеся при оплодотворении in vitro. Исследования на эмбрионах при тех же условиях допустимы в Финляндии, Испании и Швеции. Еще в девяти европейских странах законодательство либо пересматривается, либо исправляется. Европейский парламент проголосовал против как терапевтического клонирования, так и создания лишних эмбрионов. Европейская группа по этике в науке и новых технологиях, действующая при Европейской комиссии, высказалась за выделение средств из бюджета Сообщества для проведения исследований на лишних эмбрионах, однако подтвердила, что считает создание эмбрионов из донорских гамет для исследований этически неприемлемым, а терапевтическое клонирование — преждевременным (ec.europa.eu).

Что касается США, то лишь в марте 2009 г. президентом Бараком Обамой был снят запрет на государственное финансирование исследований стволовых клеток (US scientists relieved as Obama lifts ban on stem cell research, 2009; www.guardian.co.uk).

На международном уровне в декабре 2003 г. в ООН от Коста-Рики поступило заявление, в котором представители страны обратились к государствам-членам с предложением «запретить все формы человеческого клонирования, поскольку они не соответствуют принципам человеческого достоинства и защиты жизни человека» (www.un.org), однако оно не нашло поддержки у большинства стран-участниц (в основном из-за путанности формулировок и наличия у некоторых стран собственного законодательства относительно данного вопроса).

FDA одобряет…

Благодаря таким свойствам ЭСК, как пластичность и потенциально неограниченная способность к самовоспроизведению, они все чаще рассматриваются как объекты для применения в регенеративной медицине, где с их помощью можно было бы проводить замену изношенных тканей либо восстанавливать потерю таковых. Заболевания, при которых потенциально может быть использовано свойство плюрипотентности, включают гематологические, иммунологические, генетические заболевания, злокачественные новообразования, юношеский диабет, болезнь Паркинсона, слепоту и повреждения спинного мозга. 23 января 2009 г. клинические исследования I фазы по трансплантации популяции клеток — предшественников человеческой стволовой клетки (human-ES-derived) у больных с травмами позвоночника и спинного мозга получило одобрение Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (Food and Drug Administration — FDA) (www.cnn.com ; www.apteka.ua). Таким образом, это исследование стало первым клиническим испытанием подобного рода с участием человека. Эксперимент, предшествовавший данному прогрессу, проводился Гансом Кеирстидом (Hans Keirstead) с коллегами из Калифорнийского университета (University of California; Ирвайн) при поддержке компании «Geron Corp.» (Менло Парк, Калифорния). Результаты проведенного доклинического исследования предполагали восстановление двигательной активности у крыс с пораженным спинным мозгом. На седьмой день после трансплантации ЭСК человека дифференцировались в олигодендроциты (Keirstead H.S., Nistor G., Bernal G. et al., 2005). В предложенное клиническое исследование I фазы вовлечены 8–10 пациен­тов с параличом нижних конечностей, который развился не позже чем за 2 нед до исследования. Однако исследователи подчеркивают, что инъекцион­ное введение ЭСК не сможет полностью восстановить двигательную активность пациентов. Основываясь на результатах исследований, проведенных в эксперименте, ученые говорят, что вероятно лишь некоторое восстановление миелиновой оболочки и увеличение подвижности. В данном исследовании в первую очередь будет изучена безопасность подобной процедуры и лишь в случае успеха возможно продолжение в будущем исследований с участием пациентов с более тяжелыми нарушениями (www.washingtonpost.com; FDA OKs 1st Embryonic Stem Cell Trial, 2009). Однако с августа 2009 г. исследование было приостановлено — в нескольких экспериментальных образцах FDA было обнаружено небольшое количество микроскопических кист. Если последующие результаты эксперимента будут позитивными, клиническое исследование сможет возобновиться к концу 2010 г. (Geron comments on FDA hold on spinal cord injury trial, 2009; www.geron.com).

Неголословным и наглядным примером важности исследования безопасности подобных методов терапии стал случай, описанный сотрудниками Исследовательского онкологического центра медицинского центра им. Хаима Шиба (Cancer Research Center, Sheba Medical Center; Рамат-Гане, Израиль) и Медицинской школы Саклера (Sackler School of Medicine) Тель-Авивского университета (Tel Aviv University; Тель-Авив, Израиль). Израильский мальчик, страдающий редкой наследственной болезнью атаксия-телеангиэктазия (ataxia-telangiectasia; синдром Луи-Бар), в 2001, 2002 и 2004 г. в возрасте 9, 10, 12 лет соответственно получал в Москве лечение стволовыми клетками, вводимыми инъекционно. Спустя 2 года после терапии, в 14-летнем возрасте, при томографическом исследовании были обнаружены опухоли в спинном и головном мозгу. В ходе анализа генов клеток опухоли обнаружился ее химерный характер — опухоль составляли не только клетки пациен­та, но и клетки по крайней мере двух разных доноров стволовых нервных клеток. О данном случае в феврале 2009 г. в медицинском журнале «PLOS Medicine» была опубликована статья, авторы которой подчеркивают, что это первый случай доказанного образования опухоли из клеток донора при трансплантации нервных клеток. Однако авторы статьи не утверждают, что именно трансплантация вызвала развитие опухоли. Они отмечают, что болезнь, которой страдает пациент, часто сопровождается появлением опухолей в спинном и головном мозгу. Другое дело, что в данном случае трансплантация могла так или иначе обусловить этот процесс. В заключении авторы статьи подчеркивают: «наше исследование не предполагает запрещения работ, связанных с лечением стволовыми клетками. Оно, однако, настоятельно рекомендует проведение широких исследований биологических основ эмбриональной терапии, глубокого и детального доклинического анализа в каждом случае, в особенности в отношении безопасности пациента. Это должно максимизировать пользу и минимизировать риски» (www.plosmedicine.org; Amariglio N., Hirshberg A., Scheithauer B.W. et al., 2009).

Несмотря на теоретически многообещающие выгоды, эффективность терапии с использование­м стволовых клеток даже в эксперименте оказывается еще менее успешной. Так, независимо от того, какие стволовые клетки использовались — нервного ряда, гематопоэтические, стромы костного мозга, эмбриональные или индуцированные плюрипотентные, — результат оказывался один: значительную часть этих клеток ждала быстрая гибель вскоре после трансплантации.

Анализ трех методик доставки клеток к спинному мозгу (люмбальной пункции, внутривенной инъекции и непосредственного введения в спинной мозг), проведенный специалистами из медицинского колледжа Университете Дрекселя (Drexel University College of Medicine; Филадельфия, США), показал, что через три недели после манипуляции приживление стромальных костномозговых клеток в спинном мозгу было неэффективным во всех трех случая­х (Scudellari М., 2009). Аналогичные результаты были получены сотрудниками Университета Калгари (University of Calgary) — 95% подсаживаемых стволовых клеток попросту гибнут, хотя добавление коктейля из факторов роста, противо­воспалительных средств и иммуносупрессантов позволило в одном из исследований добиться 40% выживаемости стволовых клеток (Karimi-Abdolrezaee S. et al., 2006 ; Scudellari М., 2009).

В поисках лучших методик доставки стволовых клеток исследователи стали выходить за рамки обычных инъекций. Так, одним из новых подходов является помещение клеток в инертную матрицу из гидрогелей, натуральных или синтетических не растворимых в воде полимеров. Они могут быть использованы как своеобразные леса вокруг спинного мозга, на которых стволовые клетки могут быть зафиксированы и откуда начать свой рост (Zahir T., Nomura H., Guo X.D. et al., 2008). Эта методика улучшила выживаемость клеток in vivo, но не повлияла на восстановление функций у животных. Кроме того, фиксация трубки к спинному мозгу является высокоинвазивным вмешательством, возможные риски при котором могут перевешивать возможные благоприятные эффекты. Также опасно и непосредственное введение клеток в спинной мозг. Таким образом, в экспериментах на животных получены очень скромные результаты эффективности использования стволовых клеток, отмечает Меган Скуделлари в опубликованной в конце 2009 г. в журнале «Nature» статье (Scudellari М., 2009).

Несколько исследований по изучению эффективности стволовых клеток с участием человека было проведено в России, Бразилии и Японии. В них преимущественно использовались стволовые клетки, полученные из крови или костного мозга самого пациента, однако организация большинства из них не соответствует стандартам FDA в плане контроля, точности документации и длительности наблюдения. Кроме того, повреждения спинного мозга характеризуются крайне высокой вариабельностью самостоятельного восстановления в течение первых трех месяцев, что для получения достоверных результатов требует вовлечения в исследование нескольких сотен пациентов.

Исследования эффективности стволовых клеток в лечении заболеваний сердца, в отличие от таковых спинного мозга, ведутся в Европе и Северной Америке. В первых исследованиях клеток костного мозга и миобластов, введенных в ткань сердца, ученые ожидали увидеть их дифференциацию в кардиомиоциты, однако этого так и не произошло. Единственными клетками, продемонстрировавшими способность превращаться в кардиомиоциты, оказались ЭСК и индуцированные клетки-предшественники. Так же, как и в ситуации со спинным мозгом, большая часть введенных стволовых клеток обычно почти сразу же погибает. Во время II фазы рандомизированного двойного слепого клинического исследования, проводившегося в 21 академическом госпитале Европы в 2002–2006 гг., было показано, что прямое их введение в сердце является плохо воспроизводимым, а кластеры прижившихся стволовых клеток повышают риск развития сердечной аритмии (Menasch? P., Alfieri O., Janssens S., 2008).

Вместе с тем, несмотря на многочисленные поражения, ученых это не останавливает: по состоянию на 14 мая 2010 г. по запросу «stem cells» в регистре клинических исследований Национального института здоровья США (National Institute of Health) www.clinicaltrial.gov всего зарегистрировано 3025 исследований, из них 1434 — на стадии регистрации и набора пациентов; бо льшая часть (2022) таких исследований проводится в США, 673 — в ЕС, 193 — в Канаде, 129 — Китае, 107 — Австралии (www.clinicaltrial.gov).

Пока же развитые страны проводят исследования эффективности и безопасности применения стволовых клеток, в ряде неевропейских стран «медицина» стволовых клеток бурно развивается: существующее множество клиник в Китае, Индии, Южной Корее и Бразилии предлагает всем желающим пройти лечение стволовыми клетками, в том числе и эмбриональными. Так, в Индии некто доктор Гита Шрофф (Geeta Shroff) предлагает пройти лечение ЭСК; один курс лечения обходится пациенту в 30 тыс. фунтов стерлингов (www.timesonline.co.uk ; Stem cell experts sceptical of Dr Geeta Shroff’s miracle cure claims, 2009). Данные практики международными научными организациями оцениваются скептически и критически. Так, Стивен Мингер (Stephen Minger), директор Королевской биологической лаборатории стволовых клеток (King’s stem cell biology laboratory), критически высказался относительно существующих клиник в Индии, Китае, Украине и других странах, проводящих лечение стволовыми клетками. Он отметил, что «пациенты чаще всего не имеют понятия, что им вводится, откуда берутся эти стволовые клетки, как они хранятся и проверяются ли они на отсутствие патогенной микрофлоры» (www.timesonline.co.uk). Ученые предупреждают, что важно извлечь уроки из таких катастроф, как, например, ВИЧ-инфицирование пациентов с гемофилией, которые были заражены СПИДом при переливании непроверенной крови (news.bbc.co.uk). Несмотря на всю увлекательную перспективность стволовых клеток, степень их изученности и уровень технологий тем не менее еще не достигли той степени, когда стволовые клетки можно было бы применять как лекарственные средства, предназначенные для человека, — науке лишь предстоит на протяжении многих лет преодолеть их интенсивные исследования.

Валерий Юдин по материалам

Коментарі

Коментарі до цього матеріалу відсутні. Прокоментуйте першим

Добавить свой

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *

*

Останні новини та статті